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活細胞染色觀察&活細胞骨架染料
2016-06-08 15:37:49 來源：
Actin-肌動蛋白是細胞骨架不可或缺的一個組成部分，其在很多*基礎的細胞活動中扮演著非常重要的角色。尤其在細胞形態，遷移和研究細胞機制中，肌動蛋白都是一個非常理想的觀測蛋白。肌動蛋白是由小球狀的G-actin聚合成絲狀的F-actin動態交互變化構成的，從而參與了細胞活動中的各種細胞骨架的變化。通常研究活細胞中actin的活動用的是轉染actin-GFP融合蛋白的質粒，可以同時標記F-actin和G-actin，可以有效的反映出細胞骨架的相對活性，但是當值需要觀測F-actin的時候，使用actin-GFP會降低信噪比，難以專一捕捉F-actin的活動。更有研究顯示，使用actin-GFP會直接影響細胞遷移和細胞分裂中的肌動蛋白活性。
2015年英國的科研人員研究了幾種可以標記F-actin染料發現LifeAct是一種觀測F-actin非常理想的染料，其能特異性結合F-actin而不會影響肌動蛋白的活性，能夠很好的顯現出肌動蛋白的結構。LifeAct是一個17個氨基酸形成短肽，由于其很小，不會被哺乳動物細胞當作外來蛋白清除，從而使一個非常理想的F-actin標記物。文中，以人間充質干細胞（hMSCs， Human mesenchymal stem cells）為載體，研究LifeAct-GFP對比actin-GFP在觀測肌動蛋白中的應用。
Differential effects of LifeAct-GFP and actin-GFP on cell mechanics assessed using micropipette aspiration
K. Sliogeryte, S. Thorpe, Z. Wang, C. Thompson, N. Gavara and M. Knight
Journal of Biomechanics, 2015, 10.1016/j.jbiomech.2015.12.034
（一）實驗材料
1) 細胞: hMSCs （STEMCELL Technologies，UK）
2) 試劑: LifeAct-TagGFP2 質粒 （ibidi， Germany）
DMEM （Gibco）
Actin-GFP
Lipofetamine LTX Plus (Invitrogen)
4%多聚甲醛溶液
0.5%Triton X-100
3) 耗材：玻璃管（外徑1mm，內徑0.58mm）
（二）實驗步驟
1、LifeAct-GFP和 actin-GFP轉染
l 使用未分化的hMSCs細胞轉染actin-GFP質粒。
l 無抗生素10%FBS低葡萄糖DMEM培養細胞30min到1h
l 使用Lipofetamine LTX Plus轉染質粒，按照說明書將細胞在轉染培養基中培養6小時。
l 使用未分化的hMSCs細胞和，hMSCs細胞分化的永生化軟骨細胞系感染含LifeAct-TagGFP2的腺*。
2、固定細胞的肌動蛋白結構
使用Alexa Flour555-phalloidin標記F-actin
l 單層細胞貼壁染色，是將已經用LifeAct-GFP和 actin-GFP轉染的細胞，用4%多聚甲醛固定10分鐘，再用0.5%Triton X-100通透5分鐘，再用Alexa Flour555-phalloidin染色20分鐘。
l 懸浮細胞染色，是將已經用LifeAct-GFP和 actin-GFP轉染的細胞消化為單細胞，再在懸浮液中直接用4%多聚甲醛固定10分鐘，再用0.5%Triton X-100通透5分鐘，再用Alexa Flour555-phalloidin染色20分鐘。
3、微管吸吮技術
l 將外徑1mm，內徑0.58mm玻璃管拉為內徑7-8μm的微管
l 使用注射泵維持微管內有0.76kPa的負壓
l 輕輕吸取細胞，每2秒采集一張圖片
l 細胞在微管負壓情況下會有不規則的突起，進入微管，能很好的觀測F-actin的活動。
（三）實驗結果
1、鬼筆環肽和LifeAct-GFP和 actin-GFP轉染共定位（圖一）
圖一：鬼筆環肽和LifeAct-GFP和 actin-GFP轉染共定位：A、E）貼壁細胞中，LifeAct-GFP和 Actin-GFP 在標記F-actin時都表現很好，但是在懸浮細胞中，C、G）雖然LifeAct-GFP和 Actin-GFP和鬼筆環肽都能共定位F-actin，但是actin-GFP在整個細胞中都有染色，因為其同時染G-actin沒有凸顯出F-actin。
2、微管吸吮技術使細胞發生形變，觀察F-actin活動（圖二）
圖二：微管吸吮技術造成細胞形變。A）LifeAct-GFP可以很好的追蹤F-actin，會根據細胞的形變，標記到細胞突起的*外緣的骨架；B）使用Actin-GFP標記沒有特異性，不能看到細胞變形中*邊緣的骨架。
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