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細胞趨化實驗新方法：可實時觀察細胞動態
2016-04-26 17:10:01 來源：
細胞趨化性（Chemotaxis，亦被稱為化學趨向性）是趨向性的一種，指細胞、細菌及其他單細胞、多細胞生物依據環境中某些化學物質而趨向的運動。趨化性對細胞的發展和其他正常功能一樣不可或缺。
在這里，我們以小鼠樹突狀細胞為例，介紹一個細胞的化學趨化實驗。
一、實驗材料準備：
- 儀器：
- 細胞培養箱（高濕度，37℃，5%CO2）
- 倒置顯微鏡，具有10X相差物鏡和定時拍照功能
- 鏡載加熱孵育系統（37℃，5%CO2）
- 可選配置：全自動載物臺，自動對焦系統
- 分析軟件：可選用手動分析軟ImageJ的“Manual Tracking”模塊，或全自動的ibidi提供的WimTaxis進行細胞軌跡追蹤。*后使用ibidi公司的“Chemotaxis and Migration Tool” 進行數據統計分析。
- 樹突狀細胞：
為了減少ibidi細胞趨化載玻片與培養基中的氣泡，將載玻片和培養基提前24小時放入培養箱中
將8-10天的樹突狀細胞用200 ng/ml LPS 過夜處理（培養基等試劑見表一）
表一：細胞培養和活化所需的試劑盒培養基
*Lutz, M. B. et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods 223, 77–92 (1999)
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基質膠制備，Collagen I，bovine，1.6mg/ml
樹突狀細胞的化學趨化實驗所需的試劑如下：
表二：化學趨化需要的耗材和試劑
表三：制備1.6mg/ml 基質膠
操作步驟：
- 使用表一中的培養基制備 9 x 106 cells/ml 的細胞懸液
- 在1.5ml離心管中小心混勻表三中的1和2號試劑，避免產生氣泡
- 在另一1.5ml離心管中準備150 μl collagen
- 使用200μl槍頭從第二步的混合液中吸取30μl（圖一A）
- 小心混勻（圖一B），避免產生氣泡
- 加入90μl細胞懸液到上一步混合液中（圖一C）
- 小心混勻（圖一D），避免產生氣泡
圖一：制備細胞-基質膠混合液圖示，注意：1）避免產生氣泡，氣泡會破壞膠原纖維，不能使用Vortex；2）膠原混合后，離膠凝大約有5分鐘時間，如果在凝膠后再進行操作會破壞膠原纖維；3）當剛加10x MEM到NaHCO3中的時候會看到顏色變化，這表明沒有充分反應，因此加入混合液到膠原蛋白中后要充分混勻。
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細胞趨化實驗
- 趨化試劑
- 化學趨化物：CCL 19（1.25 μg/ml in RPMI 1640/10%FCS）
- 無化學趨化物培養基：RPMI1640，10%FCS
- 實驗步驟
- 當細胞-基質膠混合液制備好后直接加入ibidi細胞趨化載玻片的中間通道中（圖二）
圖二，在觀測通道中加入細胞-基質膠混合液
- 將細胞趨化載玻片放入培養箱中30-35分鐘，等待膠原蛋白凝固
圖三：加入化學趨化物（紅色）和無化學趨化物培養基（藍色）
在兩邊儲液池中均加入60μl的無化學趨化物培養基作為空白對照（-/-）（圖四）
圖四：加入無化學趨化物培養基（藍色）作為空白對照
- 按說明，將通道加液孔塞緊后可以進行圖像采集
- 將載玻片置入鏡載加熱孵育系統中，調整好采集位點，進行4小時的觀測，每2分鐘采集一張圖片
圖五：明場1小時處圖像采集，由于是3D培養環境，不是所有的細胞都能被清楚的成像。
- 圖像處理
- 手動細胞軌跡追蹤
- 下載ImageJ，并安裝Manual Tracking模塊
- 導入采集的系列圖像到ImageJ中，打開模塊“Manual Tracking”，選擇“Add track”開始記錄細胞軌跡
- 選擇一個細胞，按照時間點單擊細胞，*點擊后，會有新窗口跳出來顯示初始位置，以后每次點擊，都將在這個新窗口中產生一個該細胞隨著時間的新坐標
- 統計完足夠的細胞軌跡后，保存軌跡坐標表格
- 至少收集30個細胞的軌跡才具有統計學意義，避免同一細胞追蹤兩次，去除由于凋亡會而不能采集完整的軌跡的細胞
- 可以將“Overlay dots & lines”以.avi格式導出
2）全自動細胞軌跡追蹤
使用ibidi的WimTaxis自動分析平臺，將采集的系列圖像上傳到該平臺，幾個工作日后，會得到細胞軌跡的坐標表格數據結果。
四、數據處理
使用遷移指數（ Forward Migration Indices*，FMIs）作為比較趨化實驗和對照試驗的參數。在有趨化物的情況下，空白對照的FMI和與趨化物垂直方向的化學趨化的遷移指數（FMI┴）應是在0點左右。而與趨化物平行方向的化學趨化的遷移指數（FMI‖）與0點有顯著的區別表現出了化學趨向性。同時，使用Rayleigh Test**對細胞趨化的方向性進行檢驗。如果p值大于0.05表示了細胞運動的無序性，表明沒有方向性的遷移。此外，遷移速率等參數也能直接用于分析。
*Foxman et al. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation, J Cell Biol 147, 577-588 (1999)
**Fisher, N. I. Statistical Analysis of Circular Data, Cambridge University Press, New York (1993)
五、統計結果：
六、實驗優勢總結
1.可實時觀察細胞趨化情況；
2.可計算細胞的趨化速率；
3.在1組實驗中即可做出連續性趨化濃度梯度；
4.建立的濃度梯度可維持長達48小時，對快速遷移細胞或慢速遷移細胞都適用；
5.可選配套的圖像分析，輕松得到實驗數據。
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